sterilisasi dan pembuatan medium

PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI DASAR

STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIUM

Nama               : NOVITA SARI

NIM                : J1A116020

Kelompok       : IV ( empat )

Shift                : I ( satu )

Asisten            : 1. Ika Gusriani, S.TP ., MP

                          2. Haryati, S. Si

Nilai Laporan	Tanggal Terima Laporan dan Paraf Asisten

JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

UNIVERSITAS JAMBI

2017

BAB I

PENDAHULUAN

1.1.Latar Belakang.

Penggunaan prosedur fisik atau kimia untuk menghancurkan semua kehidupan mikroba, termasuk endospora bakteri yang sangat tahan hidup meskipun pada suhu ekstrem. Bakteri spora yang paling tahan dari semua organisme hidup karena mikroba memiliki kemampuan untuk menahan agen perusaknya. Karena kemampuan mikroba tersebut sehingga harus dilakukan sterilisasi untuk menghancurkan atau membunuh mikroba tersebut. Sterilisasi adalah proses  pemusnahan semua sel hidup dari suatu objek termasuk, virus, spora, viroid dan  prion. Beberapa prinsip sterilisasi eksis menurut agen mematikan yang digunakan.

Tahapan penting yang mutlak harus dilakukan selama bekerja di ruang praktikum mikrobiologi adalah sterilisasi. Bahan atau peralatan yang digunakan harus dalam keadaan steril. Sterilisasi adalah proses penghilangan semua jenis organisme hidup, dalam hal ini adalah mikroorganisme yang terdapat dalam suatu benda. Proses ini melibatkan aplikasi biocidal agent  atau proses fisik dengan tujuan untuk membunuh atau menghilangkan mikroorganisme. Setiap proses baik fisika, kimia dan mekanik yang membunuh semua bentuk kehidupan terutama mikroorganisme disebut sterilisasi. Adanya pertumbuhan mikroorganisme menunjukkan bahwa pertumbuhan bakteri masih berlangsung dan tidak sempurnanya sterilisasi.

Dalam pembuatan NA (Nutrient Agar) juga diperlukan teknik sterilisasi untuk menghindari kontaminasi terhadap bakteri yang akan ditumbuhkan. Nutrient agar adalah medium yang diklasifikasikan sebagai medium sintetik terstruktur karena tersusun oleh komponen yang pasti jenis dan kuantitasnya. Medium Nutrient agar merupakan medium umum yang dapat digunakan untuk mengkultivasi berbagai jenis bakteri. Formulasi Nutrient Agar terdiri dari daging sapi ekstrak, peptone dan agar. Formula ini tergolong relatif simpel untuk menyediakan nutrisi-nutrisi yang dibutuhkan oleh sejumlah besar mikroorganisme yang tidak terlalu fastidious.

Fungsi utama dari medium NA adalah sebagai medium kultivasi dan enumerasi bakteri. Namun, dengan tambahan beberapa bahan seperti amilum (pati), serum, dan darah, medium nutrient agar juga dapat digunakan sebagai medium pengayaan dan selektif bagi mikroorganisme tertentu serta bermanfaat dalam uji serologi dan biokimia untuk mengidentifikasi bakteri.Dalam medium NA terkandung pepton, yeast dan beef extract yang berfungsi sebagai sumber nitrogen dan sumber karbon, sumber vitamin dan beberapa senyawa lain untuk menyokong pertumbuhan bakteri. Pada medium ini terkadang juga ditambah dengan garam (NaCl) untuk menyeimbangkan tekanan osmotik sel bakteri dan medium, agar bakteri yang akan ditumbuhkan tidak mati.

1.2. Maksud dan Tujuan.

1.      Mengenal persiapan dan pengerjaan teknik sterilisasi alat, bahan dan area kerja untuk pengerjaan mikrobiologi secara aseptis.

2.      Mengetahui prosedur pembuatan medium tumbuh bakteri.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1  Sterilisasi.

Sterilisasi adalah suatu proses untuk membunuh semua jasad renik yang ada, sehingga jika ditumbuhkan di dalam suatu medium tidak ada lagi jasad renik yang dapat berkembangbiak. Sterilisasi harus dapat membunuh jasad renik yang paling tahan panas yaitu spora bakteri (Fardiaz, 1992).

 Sterilisasi yaitu proses atau kegiatan membebaskan suatu bahan atau benda dari semua bentuk kehidupan. Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik, fisik dan kimiawi. Sterilisai secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0,22 mikron atau 0,45 mikrob) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas, misalnya larutan enzim dan antibiotik. Sterilisasi secara fisik dilakukan dengan cara pemanasan atau penyinaran. Pemanasan dapat dilakukan dengan cara pemijaran, pemanasan kering, menggunakan uap air panas, dan menggunakan uap air panas bertekanan (Agalloco, 2008).

Menurut (Lay,1982), sterilisasi ada 2 jenis yaitu :

 1. Sterilisasi dengan cara fisik

 a. Pemanasan

Air dan uap adalah media panas yang baik. Dalam waktu relatif singkat, alat yang akan disterilkan akan mencapai suhu yang diinginkan. Udara adalah penyalur panas yang kurang baik. Oleh karena itu, untuk mecapai suhu yang diinginkan akan membutuhkan waktu yang cukup lama.

b. Panas kering

Cara ini untuk membunuh mikroba hanya memakai udara panas kering yang tinggi. Sterilisasi panas kering dibedakan atas:

c. Panas membara

 Dengan jalan menaruh benda yang akan di sterilkan dalam nyala api bunsen sampai merah membara. Alat yang disterilkan yaitu sengkelit, jarum, ujung pinset dan ujung gunting.

d. Melidah – apikan

 Dengan melewatkan benda dalam api bunsen, namun tidak sampai menyala terbakar. Alat yang disterilkan yaitu scalpel, kaca benda, mulut tabung dan mulut botol.

 e. Udara kering

Oven merupakan ciri umum yang dimaksud. Alat ini terbuat dari kotak logam, udara yang terdapat di dalamnya mendapat udara panas melalui panas dari nyala listrik. Alat yang disterilkan yaitu tabung reaksi, cawan petri, pipet, scalpel dari logam, gunting dan botol. Pemanasan satu jam dengan temperatur 160 derajat celcius dianggap cukup.

2. Panas Basah

Yang dimaksud panas basah adalah pemansan menggunakan air atau uap air. Uap air adalah media penyalur panas yang terbaik dan terkuat daya penetrasinya. Panas basah mematikan mikroba. Oleh karena koagulasi dan denaturasi enzim dan protein protoplasma mikroba. Untuk mematikan spora diperlukan panas basah selama 15 menit pada suhu 121 o C. Sterilisasi panas basah dapat dibedakan atas tiga golongan yaitu :

·         Panas basah <100 derajat Celcius (Pasteurisasi)

Pasteurisasi yaitu pemanasan pada suhu 60 o C selama 30 menit. Pasteurisasi tidak dapat membunuh spora atau dipanaskan pada suhu 71,6 – 80 o C selama 15 – 30 detik kemudian cepat – cepat didinginkan.

·         Panas basah pada suhu 100 derajat celcius

 Di sini menggunakan air mendidih (suhu 100 derajat celcius) selama 10 menit. Untuk mematikan bentuk spora dilakukan pemansan 3 hari berturut – turut selama 15 – 45 menit sehingga spora yang tidak mati pada pemanasan pertama akan berubah menjadi bentuk vegetatif pada hari kedua seteleh inkubasi pada shu 37 derajat celcius begitu pula spora yang tidak mati pada hari kedua, akan berubah menjadi bentuk vegetatif pada hari ketiga.

·         Panas basah >100 derajat celcius

Sterilisasi dengan cara ini hasilnya mutlak steril, sehingga biasa dipergunakan di rumah sakit dan laboratorium besar. Cara ini menggunakan tangki yang diisi dengan uap air yang disebut autoclave. Alat yang disterilkan adalah alat dari kaca, kain kasa, media pembenihan, cairan injeksi, dan bahan makanan.

3. Filtrasi / Penyaringan

 Penyaringan dilakukan dengan mengalirka larutan melalui suatu alat penyaringan yang memiliki pori–pori cukup kecil. Untuk menahan mikroorganisme dengan ukuran tertentu. Saringan yang umum digunakan tidak dapat menyaring virus. Penyaringan dilakukan dengan untuk mensterilkan cairan yang tidak tahan terhadap pemanasan dengan suhu tinggi seperti : serum, larutan yang mengandung enzim, toksin kuman, ekstrak sel, antibiotik dan asam amino.

4. Radiasi / Penyinaran

 Mikroorganisme dapat dibunuh dengan penyinaran yang memakai sinar ultrraviolet yang panjang gelombangnya antara 220 – 290 nm. Radiasi paling efektif adalah 253,7 nm. Sinar matahari langsung mengandung sinar ultraviolet 290 nm, sehingga sinar matahari adalah sinar yang bersifat bakterida yang baik.

Menurut (Lay,1982), Zat kimia yang dapat digunakan untuk sterilisasi dapat berwujud :

a. Gas : Ozon, formaldehyde, ethylene oxide gas.

b. Larutan : deterjen, yodium, alcohol, peroksida fenol, formalin, AgNO3 dan     merkuroklorid.

Autoklaf adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang digunakan dalam mikrobiologi menggunakan uap air panas bertekanan. Tekanan yang digunakan pada umumnya 15 Psi atau sekitar 2 atm dan dengan suhu 121o C (250o F). Jadi tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan benda adalah 15 pon tiap inchi2 (15 Psi = 15 pounds per square inch). Lama sterilisasi yang dilakukan biasanya 15 menit untuk 121o C. Autoclave yaitu alat serupa tangki minyak yang terdapat diisi dengan uap. Medium yang disterilkan ditempatkan didalam autoclave ini selama 15 sampai 20 menit, hal ini tergantung pada banyak sedikitnya yang diperlukan untuk sterilisasi. Medium yang akan disterilkan itu lebih baik ditempatkan dalam beberapa botol agak kecil dari pada dikumpul dalam satu botol yang besar (Black Sweet Ranger, 2008).

Pada saat melakukan sterilisasi, kita sebenarnya memaparkan uap jenuh pada tekanan tertentu selama waktu dan suhu tertentu pada suatu objek, sehingga terjadi pelepasan energi laten uap yang mengakibatkan pembunuhan mikroorganisme secara inversibel akibat denaturasi atau koagulasi protein sel (Hadioetomo, 1993).

2.2  Pembuatan Media.

Mikroorganisme sebagai makhluk hidup sama dengan organisme hidup lainnya, sangat membutuhkan energi dan bahan-bahan untuk membangun pertumbuhannya, seperti dalam sintesa protoplasma dan bagian-bagisn sel yang lainnya. Bahan-bahan tersebut disebut nutrien. Untuk memanfaatkan bahan-bahan tersebut, maka sel memerlukan sejumlah kegiatan, sehingga menyebabkan perubahan kimia di dalam selnya. Semua reaksi yang terarah yang berlangsung di dalam sel ini disebut metabolisme. Metabolisme yang melibatkan berbagai macam reaksi di dalam sel tersebut, hanya dapat berlangsung atas bantuan dari suatu senyawa organik yang disebut katalisator organik atau biasa disebut biokatalisator yang dinamakan enzim. Untuk dapat memahami tentang nutrisi dan metabolisme ini, pengetahuan dasar biokimia angat dibutuhkan (Natsir dan Sartini, 2006).

Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu  bahan yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekul-molekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media pertumbuhan maka dapat dilakukan isolat mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya (Hidayat dkk: 2006).

Menurut Anna Rakhmawati (2013), Persyaratan yang harus dipenuhi dalam penyiapan medium supaya mikroorganisme dapat tumbuh baik adalah:

1.      Mengandung semua nutrisi yang mudah digunakan oleh mikroba.

2.      Mempunyai tekanan osmose, tegangan permukaan, dan pH yang sesuai.

3.      Tidak mengandung zat-zat penghambat.

4.       Steril.

BAB III

METODOLOGI

3.1. WAKTU DAN TEMPAT

      Waktu:  Rabu, 05 April 2017 pukul 15:00

      Tempat: Laboratorium Biologi.

3.2. BAHAN DAN ALAT

Adapun alat dan bahan yang diperlukan selama proses praktikum sterilisasi dan pembutan medium ini, dengan peralatan yang diperlukan antara lain:

1.      12 Erlenmeyer 250 ml, 10 erlenmeyer 500 ml.

2.      3 Batang pengaduk.

3.      40 Tabung reaksi.

4.      3 Rak tabung reaksi.

5.      50 Cawan petri.

6.      Autoklaf.

7.      Oven.

8.      Pemanas listrik/hot plate stirrer.

9.      3 Pipet volumetrik.

10.  Bunsen.

11.  Botol semprot alkohol.

Sedangkan bahan yang diperlukan antara lain:

1.      NA ( Nutrient Agar ).

2.      Akuades.

3.      Kapas.

4.      Aluminium foil.

5.      Plastik wrap.

6.      Kertas pembungkus.

7.      Tissue.

8.      Kertas label.

9.      Alkohol 70 %

10.  Spritus. 

3.3. SKEMA KERJA

3.3.1. Pembuatan Medium NA

Cara kerja:

1.      Timbanglah media NA sesuai prosedur dikemasan. (catatan: buatlah 250 ml media NA untuk setiap shift praktikum). Penimbangan media dilakukan secara teliti dan cepat, kemudian serbuk media dimasukkan secara hati-hati ke dalam erlenmeyer.

2.      Tambahkan akuades dan aduk sampai merata dengan batang pengaduk.

3.      Panaskan dengan hari-hati menggunakan penangas/elemen pemanas sampai media tercampur homogen (ditunjukkan dengan warna kuninng jernih). Perhatian : sewaktu pemanasan jangan sampai terbentuk buih berlebih sampai meluap!.

4.      Sterilkan media dalam erlenmeyertersebut dengan menggunakan autoklaf:

1.      Buka tutup autoklaf.

2.      Masukkan air kedalam autoklaf hingga penanda batas air.

3.      Tempatkan bahan/medium ke dalam autoklaf, susun rapi.

4.      Tutup autoklaf, putar kunci dengan kencang.

5.      Nyalakan autoklaf dan tunggu hingga suhu mencapai 121 derajat celcius dan tekanan sebesar 2 atm (kondisi sterilisasi). Jangan lupa menutup katup autoklaf.

6.      Mulai sterilisasi selama 15 menit.

7.      Setelah selesai matikan autoklaf.

8.      Tunggu hingga tekanan turun 0 atm (suhu agak dingin).

9.      Buka secara hati-hati penutup autoklaf.

10.  Keluarkan alat dan medium dari dalam autoklaf.

5.      Medium yang telah siap dan tidak akan segera digunakan, sebaiknya disimpan di dalam lemari/ruang pendingin dengan suhu 10 derajat celcius untuk mencegah terjadinya kontaminasi.

 3.3.2. Sterilisasi Alat

Cara kerja:

1.      Bungkus rapi alat-alat gelas yang akan disterilkan dengan kertas pembungkus/aluminium foil.

2.      Sterilisasi dengan oven:

1.      Buka pintu oven.

2.      Tempatkan alat ke dalam oven dengan susunan rapi.

3.      Tutup pintu oven.

4.      Setting suhu oven: 60-180 derajat celcius selama 1-3 jam.

5.      Mulai sterilisasi.

6.      Setelah selesai, matikan oven.

7.      Tunggu beberapa saat sehingga suhu turun.

8.      Keluarkan alat dari oven.

3.3.3 Sterilisasi Area Kerja.

Cara kerja:

1.      Bersihkan meja dari alat/bahan yang ada di atasnya.

2.      Usap bersih dengan menggunakan tissue.

3.      Semprot merata dengan alkohol 70 %.

4.      Ratakan dengan tissue bersih.

5.      Tunggu hingga kering.

6.      Nyalakan bunsen.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1.  Data Pengamatan.

Berikut ini adalah tabel data pengamatan praktikum sterilisasi dan pembuatan medium NA:

4.1.1.      Data pengamatan pembuatan media NA 10 gr dengan akuades 500 ml

No	Hasil Pengamatan	Keterangan
1.	Media NA sebelum dipanaskan di hot plate.	Warna media NA cair kuning keruh (kecoklatan).
2.	Media NA sesudah dipanaskan di hot plate.	Warna media NA cair kuning bening.

4.2 Analisa Hasil.

Pada praktikum sterilisasi dan pembutan medium NA didapatkan analisa hasilnya sebagai berikut:

1.      Analisa Hasil Pembuatan media NA.

Dalam pembuatan medium pertumbuhan bakteri digunakan 10 gram NA serbuk, dengan penambahan 500 ml akuades. Serbuk NA yang dilarutkan tersebut sebelum dilakukan pemanasan pada hot plate memiliki warna kuning keruh (kecoklatan). Selanjutnya medium cair yang sudah dibuat akan dilakukan pemanasan menggunakan hot plate. Tanda bahwa medium cair sudah mencapai tahap pemanasan adalah warnanya kuning bening. Ini sesuai dengan praktikum yang dilaksanakan yaitu setelah dilakukan pemanasan pada hot plate dengan putaran 7 dan suhu 50 derajat celcius medium cair NA berubah warna menjadi kuning  bening. Warna kuning keruh sebelum pemanasan, ini berarti larutan masih belum steril. Lalu larutan NA dipanaskan menggunakan hot plate. Pemanasan dilakukan sambil diaduk menggunakan magnetik stirrer yang bertujuan agar Nutrien Agar larut sempurna dan menghasilkan larutan berwarna kuning yang jerni

4.3  Pembahasan.

Dalam praktikum dengan judul sterilisasi dan pembuatan medium NA. Praktikum tentang sterilisasi belum dilakukan, sehingga disini akan dibahas tentang pembuatan medium NA.

Dalam pembuatan medium NA dilakukan dengan cara melarutkan 10 gr NA dengan 500 ml akuades. Sebelum dilakukan pemanasan warna cairan medium NA kuning keruh. Lalu dipanaskan dengan menggunakan hot plate dan didalam larutan NA cair tersebut dimasukkan stirer yang berfungsi sebagai pengaduk larutan agar larutan tersebut homogen. Hot plate yang digunakan untuk memanaskan media NA diatur putarannya dan suhunya. Jumlah putarannya 7 dengan suhu 50 derajat celcius diikuti oleh pengadukan dengan menggunakan magnetik stirrer. Tujuan dari pemanasan dan pengadukan ini adalah untuk mempercepat homogenisasi NA dengan akuadest, dimana dengan pemanasan dapat mempercepat pelarutan dari NA dengan akuades. Setelah dipanaskan sampai kira-kira larutan menjadi bening kekuning-kuningan sebagai tanda larutan telah homogen.

Medium cair NA dalam erlenmeyer yang sudah dipanaskan selanjutnya, dimasukkan kedalam erlenmeyer 250 ml dengan isi medium cair NA masing-masing 125 ml. Erlenmeyer yang sudah berisi medium NA cair ditutup menggunakan kapas dan dilapisi menggunakan kertas aluminium foil serta diberi label nama sesuai kelompok dan shift praktikum. Tujuan dari penutupan ini dimaksudkan agar meminimalkan kontaminasi. Setelah selesai semua, erlenmeyer ditutupi dengan plastik wrap dan erlenmeyer yang berisi medium NA cair tersebut dimasukkan ke dalam lemari pendingin untuk disimpan agar tidak terkontaminasi.

Tujuan untuk pembuatan medium NA itu sendiri adalah untuk menumbuhkan bakteri yang akan ditumbuhkan pada praktikum selanjutnya.

BAB V

PENUTUP

5.1. KESIMPULAN

Dalam praktikum ini dapat disimpulkan beberapa hal yaitu:

1.      Pembuatan medium NA dilakukan dengan melarutkan 10 gr NA dengan 500 ml akuades.

2.      Warna NA cair sebelum dipanaskan kuning keruh.

3.      Warna NA cair sesudah dipanaskan kuning jernih.

5.2. SARAN

Dalam melakukan praktikum harus dengan teliti dan dilakukan dengan steril untuk menghindari kontaminasi pada medium. Dalam melakukan praktikum listrik yang digunakan harus memadai sehingga tidak mengganggu praktikum yang sedang berlangsung karena harus memanaskan medium cair dari hot plate ke kompor.

DAFTAR PUSTAKA

Anna Rakhmawati. 2012. Penyiapan media mikroorganisme. http://staffnew.uny.ac.id/upload/132296143/pengabdian/ppm-2012-bahan-segar.pdf. Diakses pada 10 april 2017 pukul 13:32

Black Sweet Heart. 2008. Pengenalan alat (http:/wordpress.com/Pengenalan-      alat/ Blacksweetranger’s/Blog.html). Diakses pada tanggal 25 Maret 2017

Fardiaz, Srikandi. 1992. Mikrobiologi Pangan. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan PAU               Pangan dan Gizi. Institut Pertanian Bogor.

    Hadioetomo, Ratna Siri. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. PT.Gramedia Pustaka             Utama. Jakarta.

Hidayat, Nur dkk. 2006. Mikrobiologi Industri. Yogyakarta: Andi Offset.

 Indra. 2008. Sterilisasi (http//ekmon-saurus/bab-3-Sterilisasi/html). Diakses pada tanggal 25 Maret 2017. Palu.

James, Agalloco. 2008. Validation of Pharmaceutical Processes (electronic version). Informa Healthcare Inc. USA.

 Lay, B. W. dan Hastowo. 1982. Mikrobiologi. Rajawali Press. Jakarta.

 Lukas, Stefanus. 2006. Formulasi Steril. Andi. Yogyakarta.

Natsir, Djide dan Sartini, 2006, Mikrobiologi Farmasi Dasar, Universitas Hasanuddin, Makassar.

LAMPIRAN

                            Gambar (a) medium NA cair saat dipanaskan pada hot plate

 

                         Gambar (b) Medium NA cair yang sudah dipanasakan dan siap disimpan di lemari pendingin.